microRNA实验方法
microRNA实验方法
一、概观miRNA
MicroRNAs（miRNAs）是一类非编码的小RNA分子，通过与靶RNA的3´UTR互补或部分互补结合，使其降解或介导其翻译抑制，参与细胞增殖、凋亡、分化、代谢、发育、肿瘤转移等多种生物学过程。miRNAs及其衍生物在疾病诊断和治疗有很大的前景。 miRNAs基因通常位于基因间或编码蛋白基因的内含子中，在核内由RNA聚合酶II或III转录产生具有特征性茎环结构的pri-miRNA，然后在Drosha-DGCR8复合体的作用下，剪接成70nt的pre-miRNA，它由exportin5由核内运到胞浆。在胞浆内，pre-miRNA在Dicer酶作用下剪切成22bp的成熟双链miRNA，其中的一条链与RISC结合而参与基因转录后水平的调控。
miRBase数据库第21版里列有来自223物种的28645茎环结构和35828成熟miRNAs。可能近90%的人类基因受到miRNAs调控，然而，当过表达或抑制某一个miRNA时，在发生调变的众多基因当中寻找并鉴定其中起关键作用的靶基因仍然具有相当大的挑战。目前鉴定miRNA靶基因的常用策略是利用生物信息学软件预测，结合基因芯片分析以及生物学实验方法来研究miRNA的功能及寻找其中起重要作用的靶基因。此外，利用蛋白质质谱来寻找miRNA靶基因也成为一种新的途径。
二、miRNA的检测和定量
为了验证miRNA在组织细胞内的表达，目前常用来检测miRNA的技术主要有以下几种：Northern杂交，原位杂交， Stem-loop实时定量RT－PCR。这三种技术各有利弊，可以相互结合应用，来反映细胞内miRNA的真实表达水平。
Northern杂交
MicroRNA是一类很小的分子，部分microRNA表达水平可能很低，因而需要极为灵敏而定量的分析工具。由于其分子很小，用RT-PCR的方法来定量研究有一定困难，特别是重复性较差，步骤繁琐等。目前多数研究人员采用Northern Blot，它是一种重复性好、灵敏高、直接的方法,可以用来检测microRNA的存在、表达量的变化等。而由于放射污染等原因，同位素标记的探针的使用有一定的局限性。而Exiqon公司推出的锁核苷酸（locked-nucleic acid, LNA）探针，具有稳定性高、特异性好、无放射污染等优点，成为新的Northern Blot检测探针。
Northern杂交表明从人类和小鼠来的前miR-499和成熟miR-499条带
基本原理
将待检测的RNA分子变性后，通过尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离,继而按其在凝胶中的位置转移到尼龙膜上，固定后再与同位素、地高辛或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途
检测样品中的RNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
实验过程
1.提前配制无APS和TEMED的15%的Ura-PAGE胶的混合液，即50ml of Pre-Gels：
Urea: 24 g
40% Acrylamide: 18.75 mL
5x TBE Buffer: 10 mL
ddH20: 0 mL
2.器皿的清洗：器皿同Western Blotting装置。
用清水冲洗干净，乙醇擦干3%；
H2O2 填充浸泡电泳槽、玻璃片、梳子10分钟；
用0.1% DEPC处理过的水冲洗电泳槽，梳子和玻璃片。
用RNAase Away 擦海绵和其他相关器材。
安装配胶装置。
3.配胶：取10 ml Pre-Gels，加入33.3- 45 ul的APS 和 10-20ul的TEMED，混匀，加入玻片中，加入10或15齿梳子。大约30-60 min 即可凝好。
4.RNA样品的准备 Small RNAs（大约107细胞） （或者Total RNA ~20-200ug） 在 ~18ul DEPC H2O 加入 2ul 10xRNA loading buffer。 95℃加热 5min, 冰上冷却。 瞬时离心收集RNA样品。
5.电泳：（装置同Western Blotting电泳装置），电泳液1xTBE。15% Urea-PAGE 在电泳液 1xTBE进行电泳。电压180V 直到溴芬兰到达胶的底部。根据Ambion公司的步骤，在上样之前，300V 预电泳10min（防止胶漏同时活化胶），然后用电泳液1xTBE冲洗孔，将尿素冲出后然后小心、迅速加样。选用的是Roche公司提供的LNA-labeled DNA作为对照，同时将自己合成的RNA Oligo作为阳性对照（总量为1 pmol即可）。其中 溴芬兰的对应的分子量为13nt左右，二甲苯青FF对应的为40 nt左右。
6.转膜（装置同Western Blotting转膜装置），转膜液为0.5ⅹTBE。
